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Technische FAQ
Allgemeine Fragen
Der Brechungsindex des Einbettmediums der meisten unserer fertig-immobilisierten Proben beträgt 1,46. Die einzige Ausnahme bilden dabei die GATTA-PAINT-Proben, deren Einbettmedium auf wässriger Pufferlösung basiert und somit einen Brechungsindex von 1,33 aufweist.
Die fertig-immobilisierten Proben sind in Polymer eingebettet, welches stabilisierende Reagenzien enthält.
Ja, prinzipiell können wir Sonderanfertigungen mit allen kommerziell erhältlichen organischen Farbstoffen oder fluoreszierenden Proteinen anbieten. Beachten Sie dabei jedoch, dass eine Änderung des Fluorophors die Messergebnisse beeinflussen und möglicherweise zu einer verschlechterten Datenqualität führen kann. Wir verwenden hauptsächlich ATTO- und Alexa-Farbstoffe, da sich diese außerordentlich gut für Einzelmolekül- und Superauflösungsanwendungen eignen und somit unter entsprechenden Anwendern auch weit verbreitet sind. Wenn Sie an einer Spezialanfertigung interessiert sind, kontaktieren Sie uns bitte unter info@gattaquant.com. Wir freuen uns, Ihnen weiterhelfen zu können.
Ja, wir können Sonderanfertigungen mit Markierungsabständen im Bereich von 6 bis 350 nm anbieten. Bitte kontaktieren Sie uns dazu unter info@gattaquant.com. Wir freuen uns, Ihnen weiterhelfen zu können.
Auf einem handelsüblichen Objektträger (76 x 26 x 1 mm3) ist eine Flusskammer angebracht. Auf der gegenüberliegenden Seite enthält der Objektträger ein eingraviertes GATTAquant-Logo und trägt einen Aufkleber, auf dem die wichtigsten Kenngrößen der Probe angegeben sind. Das die Flusskammer begrenzende, Deckglas hat standardmäßig eine Größe von 22 x 22 mm2, ist auf Anfrage aber auch in 18 x 18 mm2 erhältlich. Um den hohen Ansprüchen eines Experiments auf Topniveau zu genügen und immer die beste Glasqualität zu gewährleisten, verwenden wir ausschließlich Hochpräzisions-Deckgläser #1.5 von Marienfeld mit einer Dicke von (170 ± 5) µm. Achten Sie beim Auflegen der Probe auf Ihr Mikroskop bitte unbedingt darauf, dass das Deckglas zum Objektiv hinzeigt (auf einem inversen Mikroskop würde das Deckglas dann beispielsweise nach unten zeigen, während das Logo und der Aufkleber lesbar blieben). Wenn Sie spezielle Deckgläser, andere Abmessungen oder sonstige maßgeschneiderte Lösungen benötigen, kontaktieren Sie uns bitte unter info@gattaquant.com. Wir freuen uns, Ihnen weiterhelfen zu können.
Die Nanometerlineale oder Beads sind auf der Innenseite des Deckglases (Durch zufälliges, unspezifisches Binden können sich auch Nanometerlineale auf dem Objektträger befinden. Diese sollten jedoch nicht verwendet werden!) und weisen eine Dichte von etwa 0,5 bis 2 Strukturen pro µm2 auf. Daraus ergibt sich eine zu erwartende Gesamtzahl an Nanometerlinealen bzw. Beads von einigen hundert Millionen auf jeder GATTAquant-Probe. Die Strukturen sind zufällig und homogen über das gesamte Deckglas verteilt – Aggregate aus mehreren Strukturen sind üblicherweise selten. Bitte beachten Sie, dass Nanometerlineale oder Beads deutlich kleiner als beispielsweise Zellproben sind, weshalb wir ein kleineres Sichtfeld (40 x 40 µm2 oder kleiner) empfehlen.
Weitfeld: Bitte stellen Sie sicher, dass Sie die GATTAquant-Probe gemäß der Spezifikationen Ihres Mikroskops korrekt auf den Probenhalter gelegt haben, sodass das Deckglas in Richtung des Objektivs zeigt. Verwenden Sie die richtige Menge an Immersionsöl (eine zu große Menge verstärkt Drift, während eine zu geringe Menge eine fehlerfreie Abbildung unmöglich macht) und stellen Sie das Objektiv auf eine z-Position ein, die eine Berührung von Öl und Deckglas ermöglicht, aber auch genug Spielraum lässt, um das Objektiv zum Deckglas hin zu bewegen. Wenn Sie eine wissenschaftliche Kamera für Einzelmolekül-Detektion (z.B. EMCCD oder sCMOS) verwenden und eine ausreichende Laserleistung eingestellt haben, sollten Sie in der Lage sein, die Öl-Schicht daran zu erkennen, dass Sie dort kleine, umherschwimmende Partikel sehen können (es ist allerdings nicht zwingend erforderlich, die Öl-Schicht sehen zu können). Generell empfehlen wir, unbedingt die Kamera zum Suchen der Oberfläche zu verwenden (mit einer Bildgröße von 40 x 40 µm2 oder kleiner), da ein Auffinden der Oberfläche mittels Okular sehr anspruchsvoll ist und darüber hinaus keine wirklichen Vorteile gegenüber der Methode mit Kamera aufweist. Während der Annäherung an das Deckglas wandert der Fokus zunächst durch die Öl-Schicht und passiert dann die Öl-Glas-Grenzschicht (abhängig von Ihren Einstellungen wird dabei möglicherweise eine dunkle, inhomogen schmutzig erscheinende Oberfläche sichtbar). Ausgehend von dieser Grenzfläche sind es noch weitere 170 µm bis zur korrekten Bildebene, also der Grenzfläche zwischen Deckglas und Einbettungsmedium (sehen Sie sich dazu auch das Video in der How-To-Use Section an). Wenn Sie die korrekte Fokusebene gefunden haben, sollten Sie die einzelnen, homogenen PSF-Signale der Nanometerlineale oder Beads erkennen können. Wenn Sie sphärische Aberrationen oder elliptische PSFs beobachten, reinigen Sie bitte das Deckglas und das Objektiv, tragen neues Immersionsöl auf und starten erneut. Wenn Sie ein niedriges Signal-Rausch-Verhältnis, ein starkes Hintergrundsignal oder leicht verzerrte PSFs beobachten, sind Sie wahrscheinlich auf der falschen Bildebene (z.B. auf der Grenzfläche zwischen Einbettmedium und Objektträger oder zwischen Öl und Deckglas). Nachfolgend sind einige typische Parameter für die Abbildung unter TIRF-Bedingungen angegeben: Laserleistung: 3 bis 10 mW, EM-Gain: 50 bis 200, Integrationszeit: 30 bis 100 ms. Bitte beachten Sie, dass diese Parameter stark von Ihrem Mikroskop und Ihrer Bildausleuchtung abhängig und daher nur Vorschläge sind.
Konfokal: Bitte stellen Sie sicher, dass Sie die GATTAquant-Probe gemäß der Spezifikationen Ihres Mikroskops korrekt auf den Probenhalter gelegt haben, sodass das Deckglas in Richtung des Objektivs zeigt. Verwenden Sie die richtige Menge an Immersionsöl (eine zu große Menge verstärkt Drift, während eine zu geringe Menge eine fehlerfreie Abbildung unmöglich macht) und stellen Sie das Objektiv auf eine z-Position ein, die eine Berührung von Öl und Deckglas ermöglicht, aber auch genug Spielraum lässt, um das Objektiv zum Deckglas hin zu bewegen. Das Auffinden der korrekten Bild-Ebene kann abhängig von Ihrem Mikroskop auf verschiedene Weisen erreicht werden. Wenn Sie eine Kamera verwenden, lesen Sie bitte obigen Abschnitt für die Weitfeld-Mikroskopie durch. Falls Sie APDs als Detektoren verwenden, empfehlen wir, das Okular zur Fokussierung zu verwenden. Üblicherweise sollten Sie in der Lage sein, Rückreflexe von den Grenzflächen zu sehen. Die Öl-Deckglas-Grenzfläche verursacht einen relativ dunklen – im Idealfall sogar gar keinen – Rückreflex, da die entsprechenden Brechungsindices näherungsweise identisch sein sollten. Die erste starke Reflexion wird normalerweise von der Grenzfläche zwischen Deckglas und Einbettungsmedium erzeugt, also der korrekten Bild-Ebene. Eine weitere starke Reflexion wird sichtbar, wenn Sie mit dem Fokus zu weit in die Probe eindringen, d.h. die Grenzfläche zwischen Einbettmedium und Objektträger erreichen. Stellen Sie sicher, dass Sie die erste starke Reflexion zur Einstellung der Fokusebene verwenden. Wenn Sie ein niedriges Signal-Rausch-Verhältnis, ein starkes Hintergrundsignal oder leicht verzerrte PSFs beobachten, sind Sie wahrscheinlich auf der falschen Bildebene (z.B. auf der Grenzfläche zwischen Einbettmedium und Objektträger oder zwischen Öl und Deckglas). Nachfolgend sind einige typische Parameter für die Abbildung mit einem konfokalen Mikroskop mit Tisch-Scanning und einer Detektion über APDs angegeben: Laserleistung: 1 bis 5 µW, Scan-Geschwindigkeit: 0,5 bis 2 px/ms, Pixelgröße: 50 nm. Bitte beachten Sie, dass diese Parameter stark von Ihrem Mikroskop und Ihrer Bildausleuchtung abhängig und daher nur Vorschläge sind.
Abhängig von Ihrer Anwendung kann es sinnvoll sein, die Proben in Lösung zu bestellen. In den meisten Fällen sind jedoch fertig-immobilisierte Nanometerlineale oder Beads die geeignetere Alternative, da Sie sich in diesem Fall nicht um die Immobilisierung, die Einstellung der Anbindungsdichte, das Einbettungsmedium und weitere technische Details kümmern müssen.
Ja, wenn Sie spezielle Puffer oder Einbettmedien wünschen, kontaktieren Sie uns bitte einfach unter info@gattaquant.com. Wir freuen uns, Ihnen weiterhelfen zu können.
DNA-PAINT
DNA-PAINT ist eine lokalisierungsbasierte Superauflösungstechnik, die das benötigte Blinkverhalten durch instabiles Binden von Farbstoff-markierten Oligonukleotiden an die DNA-Origami-Struktur erzeugt (Jungmann, R.; Steinhauer, C.; Scheible, M. B.; Kuzyk, A.; Tinnefeld, P.; Simmel, F. C. Single-Molecule Kinetics and Super-Resolution Microscopy by Fluorescence Imaging of Transient Binding on DNA Origami. Nano Lett 2010, 10, 4756–4761). Da sich in der Pufferlösung frei diffundierende Farbstoffmoleküle befinden, empfehlen wir unbedingt eine Abbildung der Probe im TIRF-Modus. Der Epi-Modus würde in Verbindung mit DNA-PAINT-Proben zu einem extrem hohen Hintergrundrauschen führen, was mit einem sehr schlechten Signal-Rausch-Verhältnis einhergehen würde.
Üblicherweise empfehlen wir unsere GATTA-PAINT-oder GATTA-PAINT-HiRes-Proben für die Verwendung auf lokalisierungsbasierten Superauflösungsmikroskopen, da Proben dieser Art eine sehr hohe Haltbarkeit von einigen Monaten aufweisen auch, wenn sie fertig-immobilisiert geliefert werden (unter folgendem Link finden Sie die Abbildung einer 1-Jahr-alten Probe: http://www.gattaquant.com/files/1_year_old_super-resolution_image_of_gatta-paint_80r.png). Falls Sie Ihr Mikroskop explizit mit dem dSTORM-Mechanismus testen wollen, empfehlen wir natürlich die GATTA-STORM-Proben.
Die STORM-Proben sind speziell für Messungen vorgesehen, die nach dem sogenannten dSTORM-Prinzip Superauflösung erzielen, d.h. unter Verwendung organischer Farbstoffmoleküle (z.B. Alexa647) in Kombination mit einer Pufferlösung, die u.a. Glucoseoxidase, Katalase und β-Mercaptoethanol enthält. Weitere Informationen dazu finden Sie bei Rust, M. J.; Bates, M.; Zhuang, X. Sub-Diffraction-Limit Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM). Nat Meth 2006, 3, 793–795.
Sowohl unsere GATTA-PAINT- oder GATTA-PAINT-HiRes-, als auch unsere GATTA-STORM-Proben sind dafür vorgesehen, die erreichbare räumliche Auflösung eines lokalisierungsbasierten Superauflösungsmikroskops zu überprüfen. Der Unterschied zwischen den beiden Probenarten besteht im Wesentlichen in der Methode, mit der das benötigte An- und Ausschalten der Farbstoffmoleküle erzeugt wird. Üblicherweise empfehlen wir unsere GATTA-PAINT- oder GATTA-PAINT-HiRes-Proben für die Verwendung auf lokalisierungsbasierten Superauflösungsmikroskopen, da Proben dieser Art eine sehr hohe Haltbarkeit von einigen Monaten aufweisen auch, wenn sie fertig-immobilisiert geliefert werden. Neben der höheren Haltbarkeit weisen DNA-PAINT-Proben zudem eine deutlich bessere Photostabilität und eine höhere Photonenausbeute auf und ermöglichen somit eine prinzipiell bessere Auflösung. Falls Sie Ihr Mikroskop explizit mit dem dSTORM-Mechanismus testen wollen, empfehlen wir natürlich die GATTA-STORM-Proben. Beachten Sie jedoch bitte, dass Sie sich um die Immobilisierung und die Einstellung der korrekten
GATTA-PAINT-HiRes-Proben enthalten neben den DNA-PAINT-Nanometerlinealen auch sogenannte „Fiducial Marker“, die als Referenzpunkte zur Driftkorrektur verwendet werden können. In diesem Tutorial wird ausführlich erklärt, wie sich diese Korrektur mit Hilfe unserer Software GATTAnalysis durchführen lässt.
dSTORM
Jede Markierung eines GATTA-STORM-Nanometerlineals enthält 3 bis 4 Alexa647-Moleküle. DNA-Origami-basierte Nanometerlineale sind sehr homogen in Bezug auf die Markierungsausbeute und somit auch in Bezug auf die Anzahl an Farbstoffmolekülen pro Markierung.
Für dSTORM empfehlen wir den üblicherweise verwendeten Puffer, welcher u.a. Glucoseoxidase, Katalase und β-Mercaptoethanol enthält. Weitere Informationen dazu finden Sie bei Rust, M. J.; Bates, M.; Zhuang, X. Sub-Diffraction-Limit Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM). Nat Meth 2006, 3, 793–795.
Software: GATTAnalysis
Die Lizenz-Datei wird möglicherweise nicht richtig erkannt, wenn Sie die Software aus einer zip-Datei oder einem Netzlaufwerk heraus starten. Sollte das der Fall sein, kopieren Sie beide Dateien (Software und Lizenz) in einen lokalen Ordner auf Ihrem Computer und probieren Sie das starten der Software erneut.
Für Mehrfarbenproben können mit GATTAnalysis die Abstände für jeden Farbkanal separat bestimmt werden. In diesem Tutorial wird dies Schritt für Schritt erklärt.
Administrative FAQ
Die Lieferzeit unserer regulären Produkte beträgt etwa 2 bis 3 Wochen, da die Herstellung der Proben erst auf Anfrage erfolgt. Jede Probe ist handgefertigt und wird einer separaten Qualitätskontrolle unterzogen, bevor sie versandt wird.
Die Lieferzeit für Sonderanfertigungen hängt von einigen Faktoren ab, wie beispielsweise der Lieferzeiten der Chemikalien, die wir für die Herstellung der Proben bestellen müssen, der Komplexität des Strukturdesigns und natürlich der Menge an Proben, die Sie bestellt haben. Üblicherweise sind Sonderanfertigungen innerhalb von 4 Wochen versandfertig, kann in bestimmten Fällen jedoch auch länger dauern.
Wir entschuldigen uns für Verspätungen im Herstellungsprozess. Nichtsdestotrotz wollen wir Ihnen natürlich die bestmögliche Qualität zur Verfügung stellen, d.h. wir verschicken generell keine Proben, die nicht unseren hohen Qualitätsstandards entsprechen. Letztlich wollen wir Ihnen ein optimales Experimentieren ermöglichen, sodass wir der Meinung sind, dass Qualität immer vor Zeit geht.
GATTA-PAINT-Proben weisen bei optimaler Lagerung eine Haltbarkeit von über einem Jahr auf. Unter http://www.gattaquant.com/files/1_year_old_super-resolution_image_of_gatta-paint_80r.png finden Sie ein superaufgelöstes Bild einer 1-Jahr-alten GATTA-PAINT-Probe.
In Polymer eingebettete Proben, wie STED-, SIM- oder Bead-Proben, weisen eine Haltbarkeit von mindestens 2 Monaten auf. Nutzererfahrungen zeigen jedoch, dass diese Proben problemlos für mehr als 6 Monate verwendet werden können.
In Lösung gelieferte Proben, die bei -20°C gelagert werden haben eine Haltbarkeit von über einem Jahr.
Wir liefern unsere Produkte weltweit aus, des Weiteren arbeiten wir mit Vertriebspartnern in einigen Ländern zusammen. Eine aktuelle Lister unserer Vertriebspartner ist hier zu finden: http://www.gattaquant.com/de/service/distributoren.html
Üblicherweise verschicken wir die Proben entweder über DHL, TNT/Fedex oder über UPS.
Ja, das ist sowohl für Fedex, als auch für andere Dienste, wie UPS oder DHL möglich.
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